PN-II-RU-TE-2014-4-0604

Caracterizarea funcţională și farmacologică a sistemelor de antiport Na+/H+ din Klebsiella pneumoniae

English version eng

Contract: 68/01/10/2015
Durata: 24 luni
Sursa de finanțare: Bugetul de stat, autoritate contractantă: Unitatea Executivă pentru Finanțarea Învățământului Superior, a Cercetării, Dezvoltării și Inovării, CNCS – UEFISCDI
Buget: 550000 RON
Începutul proiectului: 01.10.2015
Sfârșitul proiectului: 30.09.2017

Rezumat

Reglarea concentraţiei intracelulare de Na+ și a pH-ului intracelular sunt necesare pentru supravieţuirea oricărui organism. Principalii efectori ai acestui proces sunt sisteme de transport activ secundar, antiporterii Na+/H+, care există în aproape toate organismele. Înţelegerea antiporterilor Na+/H+ este crucială deoarece s-a arătat că în oameni aceștia sunt implicaţi în diferite patologii, pe când în bacterii ei pot fi esenţiali pentru supravieţuire și virulenţă. Klebsiella pneumoniae este un patogen care a devenit în ultimii ani rezistent la terapia cu antibiotice și poate provoca infecţii cu o rată de mortalitate mare în pacienţi debilitaţi sau cu sistemul imunitar compromis. O înţelegere mai bună a sistemelor de transport din K. pneumoniae ar putea astfel permite dezvoltarea unor metode mai eficiente de tratament. În cadrul proiectului nostru, ne plănuim caracterizarea sistemelor de transport Na+/H+ ale K. pneumoniae: KpNhaA1, KpNhaA2, KpNhaB și KpNhaP2. Aceasta se va face în principal prin folosirea electrofiziologiei bazate pe membrane pe suport solid în combinaţie cu tehnici fluorimetrice. Scopul nostru final este dobândirea unei înţelegeri mai bune a antiportului Na+/H+ în K. pneumoniae și determinarea de parametri cinetici care să ne permită să modelăm funcţia antiporterilor în diferite condiţii. De asemenea, vom testa diferiţi inhibitori pentru a determina potenţiale soluţii de inhibare a antiportului Na+/H+ în K. pneumoniae.

Echipa de cercetare

Ș.L. Dr. Octavian Călinescu – Director de proiect
Prof. Dr. Constanța Ganea – Cercetător senior
Conf. Dr. Adrian Iftime – Cercetător postdoctoral
Ioana Tofolean – Doctorand
Alexandru Filippi – Doctorand
Rodica Zaharia – Tehnician

Participări la conferințe

1. Călinescu, O., Fendler, K., “A Universal Transport Mechanism for Na+/H+ Exchangers”, International Workshop: Proton and Proton-coupled Transport, 27-29 mai 2016, Berlin, Germania.

2. Călinescu, O., Iftime, A., Ganea, C., Fendler, K., “Electrophysiological Investigation of Prokaryotic Na+/H+ Exchangers”, Conferința Națională de Biofizică, 2-4 iunie 2016, Cluj-Napoca, România, ISSN: 2248-0749.

3. Patino-Ruiz, M., Ganea, C., Fendler, K., Călinescu, O., “Functional investigation of Na+/H+ exchangers from the pathogen Klebsiella pneumoniae”, Biophysics and Medicine of Channels and Transporters: Electrifying New Insights, 14.05.2017 – 20.05.2017, Erice, Italia.

Articole științifice

1. Călinescu, O., Linder, M., Wöhlert, D., Yildiz, Ö., Kühlbrandt, W., Fendler, K. 2016. Electrogenic Cation Binding in the Electroneutral Na+/H+ Antiporter of Pyrococcus abyssi, J. Biol. Chem. 291, 26786-26793.

2. Călinescu, O., Dwivedi, M., Patino-Ruiz, M., Padan, E., Fendler, K. 2017. Lysine300 Is Essential for Stability but not for Electrogenic Transport of the E. coli NhaA Na+/H+ Antiporter, J. Biol. Chem. 292, 7932-7941.

3. Patino-Ruiz, M., Ganea, C., Fendler, K., Călinescu, O. 2017. Competition is the basis of the transport mechanism of the NhaB Na+/H+ exchanger from Klebsiella pneumoniae. PLOS ONE. 12, e0182293.

Rezultate preconizate

  • Punerea la punct a aparaturii pentru măsurători electrofiziologice bazate pe membrane pe suport solid (SSM) și măsurători preliminare (ÎNDEPLINIT)
  • Supra-exprimarea antiporterilor Na+/H+ din K. pneumoniae: KpNhaA1, KpNhaA2, KpNhaB, KpNhaP2 în E. coli (ÎNDEPLINIT)
  • Testarea funcționalității antiporterilor Na+/H+ din K. pneumoniae (ÎNDEPLINIT)
  • Solubilizarea și purificarea antiporterilor Na+/H+ din K. pneumoniae (ÎNDEPLINIT)
  • Testarea activității antiporterilor Na+/H+ din K. pneumoniae folosind electrofiziologia SSM (ÎNDEPLINIT)
  • Caracterizarea completă prin electrofiziologie a KpNhaA1, KpNhaA2 și KpNhaB (ÎNDEPLINIT)
  • Caracterizarea KpNhaP2 prin măsurători de electrofiziologie sau de fluorescență (ÎNDEPLINIT)
  • Evaluarea potențialilor inhibitori ai antiporterilor Na+/H+ din K. pneumoniae (ÎNDEPLINIT)
  • Analiza și modelarea cinetică a antiporterilor Na+/H+ din K. pneumoniae (ÎNDEPLINIT)
  • Publicarea a 3 articole științifice (ÎNDEPLINIT)

Rapoarte de activitate științifică

Rapoartele științifice pot fi puse la dispoziție în urma unei solicitări către directorul de proiect, la adresa octavian.calinescu (at) umfcd.ro